Identifizierung eines neuartigen Gallenmarker-Clusters und einer öffentlichen Online-Vorhersageplattform basierend auf Deep Learning für Cholangiokarzinom

May 23, 2024

BMC Medicine Band 21, Artikelnummer: 294 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Cholangiokarzinom (CCA) ist ein äußerst aggressiver bösartiger Tumor, dessen Diagnose immer noch eine Herausforderung darstellt. Ziel dieser Studie war es, einen neuartigen Gallenmarker für die CCA-Diagnose auf Basis der Proteomik zu identifizieren und ein Diagnosemodell mit Deep Learning zu etablieren.

Insgesamt 644 Probanden (236 CCA und 408 Nicht-CCA) aus zwei unabhängigen Zentren wurden für die Studie in Entdeckungs-, Kreuzvalidierungs- und externe Validierungssätze unterteilt. Kandidaten für Gallenmarker wurden durch drei Proteomikdaten identifiziert und an 635 klinischen Humoralproben und 121 Gewebeproben validiert. Ein diagnostisches Multianalytenmodell, das Gallen- und Serumbiomarker enthält, wurde in einer durch Deep Learning durchgeführten Kreuzvalidierung erstellt und in einer unabhängigen externen Kohorte validiert.

Die Ergebnisse der Proteomikanalyse und der klinischen Probenverifizierung zeigten, dass das Gallenclusterin (CLU) in CCA-Körperflüssigkeiten signifikant höher war. Basierend auf 376 Probanden im Kreuzvalidierungssatz zeigte die ROC-Analyse, dass die Gallen-CLU eine zufriedenstellende diagnostische Aussagekraft aufwies (AUC: 0,852, Sensitivität: 73,6 %, Spezifität: 90,1 %). Aufbauend auf Gallen-CLU und 63 Serummarkern wurde durch Deep Learning ein diagnostisches Modell erstellt, das sieben Faktoren (CLU, CA19-9, IBIL, GGT, LDL-C, TG und TBA) umfasst und einen hohen diagnostischen Nutzen zeigte (AUC: 0,947, Sensitivität: 90,3 %, Spezifität: 84,9 %. Die externe Validierung in einer unabhängigen Kohorte (n = 259) ergab eine ähnliche Genauigkeit für den Nachweis von CCA. Zur Vereinfachung der Bedienung wurde für CCA schließlich eine benutzerfreundliche Online-Vorhersageplattform erstellt.

Dies ist die größte und umfassendste Studie, die Gallen- und Serumbiomarker zur Differenzierung von CCA kombiniert. Dieses Diagnosemodell kann möglicherweise zur Erkennung von CCA verwendet werden.

Peer-Review-Berichte

Das Cholangiokarzinom (CCA) ist als äußerst aggressiver bösartiger Tumor bekannt. Je nach anatomischer Lage der Läsion kann CCA in intrahepatisches Cholangiokarzinom (iCCA), perihiläres Cholangiokarzinom (pCCA) und distales Cholangiokarzinom (dCCA) unterteilt werden. Als zweithäufigster bösartiger Tumor im hepatobiliären System macht CCA etwa ~ 3 % aller gastrointestinalen Tumoren aus [1] und hat eine schlechte Prognose mit geringer 5-Jahres-Überlebensrate (7 bis 20 %) und hoher Sterblichkeitsrate (ca etwa 2 % der weltweiten jährlichen krebsbedingten Todesfälle), was alles auf die Schwierigkeit bei der Frühdiagnose zurückzuführen ist [2, 3].

Die Diagnose von CCA ist aufgrund des stillen klinischen Charakters und der anatomischen Lage schwierig. Derzeit wird CCA hauptsächlich durch bildgebende Verfahren wie Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) und Endoskopie erkannt, ihre diagnostischen Fähigkeiten sind jedoch enttäuschend, da sie eine mäßige Genauigkeit und eine geschätzte Sensitivität von nur 6 bis 71,9 % aufweisen [4]. , 5]. Serum CA19-9 wird häufig für die CCA-Diagnose verwendet, seine Sensitivität und Spezifität sind jedoch bestenfalls frustrierend [6, 7]. Überraschenderweise zeigen Ergebnisse der postoperativen Pathologie, dass 10–25 % der Patienten, die wegen Verdachts auf CCA operiert wurden, letztlich frei von Krebszellen sind, was den dringenden Bedarf an genaueren Diagnoseinstrumenten unterstreicht [5, 8, 9].

Galle ist die direkte Mikroumgebung für das Wachstum von Tumorzellen im Gallengang, und krebsrelevante Proteine ​​in CCA können in die Galle ausgeschieden werden und möglicherweise als Biomarker für die Diagnose verwendet werden [10, 11]. Darüber hinaus verändern sich auch viele Serummarker bei CCA [7, 12]. Die unterschiedlich exprimierten Proteine ​​in der Galle spiegeln hauptsächlich lokale Veränderungen wider, während die Serummarker hauptsächlich systematische Veränderungen in der CCA-Progression widerspiegeln [4]. Somit könnte die Kombination von Markern in Galle und Blut die Genauigkeit bei der Unterscheidung von CCA von anderen Gallenerkrankungen verbessern.

In dieser Studie haben wir die Leistungsfähigkeit eines neuartigen Gallenbiomarkers für die Diagnose von CCA identifiziert und bewertet. Darauf aufbauend wurde durch die Kombination weiterer Serummarker ein Deep-Learning-Modell etabliert. Abschließend wurde die diagnostische Leistung des Modells von einer anderen unabhängigen Gruppe validiert.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission für Humanforschung des Ersten Krankenhauses der Universität Lanzhou (LDYYLL2022-381) mit Ausnahme der Einwilligung nach Aufklärung genehmigt und in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Klinische Proben stammten aus zwei Zentren.

Insgesamt 644 Patienten wurden für die Studie in einen Entdeckungssatz, einen Kreuzvalidierungssatz und einen externen Validierungssatz unterteilt (Zusatzdatei 1: Abb. S1). Im Entdeckungssatz wurde die Galle von 5 CCA-Patienten und 4 Patienten mit Gallengangssteinen im Ersten Krankenhaus der Lanzhou-Universität für die Proteomanalyse gesammelt. Im Kreuzvalidierungssatz wurden 376 Patienten (193 Männer und 183 Frauen) aus der Abteilung für Allgemeine Chirurgie des Ersten Krankenhauses der Universität Lanzhou rekrutiert, darunter 144 CCA-Patienten und 232 Nicht-CCA-Patienten von September 2018 bis Mai 2022. Die Die Nicht-CCA-Gruppe bestand hauptsächlich aus gutartigen Gallenerkrankungen und Nicht-CCA-Krebserkrankungen. Zu den gutartigen Gallenwegserkrankungen zählten chronische Erkrankungen der Gallenwege und nichtchronische Erkrankungen der Gallenwege. Zu den chronischen Erkrankungen der Gallenwege gehörten Gallengangssteine ​​(Steine ​​im gemeinsamen Gallengang (CBD) und Steine ​​im intrahepatischen Gallengang (IBD), cholangitische Stenose, Choledochuszyste und Cholezystolithiasis, während zu den nichtchronischen Erkrankungen der Gallenwege Steine ​​im Pankreasgang und in der Gallenblase zählten Polypen und Nicht-CCA-Krebsarten umfassten das Pankreaskarzinom (PC) und das Zwölffingerdarmpapillenkarzinom (Tabelle 1). Bei den eingeschlossenen Patienten mit CCA wurde die Diagnose hauptsächlich anhand der Pathologie von chirurgisch resezierten Proben oder Biopsieproben (offene oder laparoskopische chirurgische Resektion oder mittels ERCP gewonnene Gallenbiopsie) gestellt. Gutartige Gallenerkrankungen wurden durch bildgebende Verfahren und Labortests diagnostiziert und durch Endoskopie mit einer klinischen Nachbeobachtungszeit von mindestens einem Jahr bestätigt. Während der einjährigen klinischen Nachbeobachtung wurde besonderes Augenmerk darauf gelegt, sicherzustellen, dass keiner der Patienten mit Nicht-CCA-Erkrankungen klinische oder bildgebende Anzeichen von CCA aufwies. Patienten mit CCA und Gallengangssteinen wurden ausgeschlossen.

Im externen Validierungssatz wurden von Januar 2020 bis Mai 2022 259 Patienten aus dem Krebskrankenhaus der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften rekrutiert, darunter 87 CCA-Patienten (53 Männer und 34 Frauen). Es gab keinen statistischen Altersunterschied zwischen der CCA-Gruppe und der Nicht-CCA-Gruppe (Tabelle 1). Daten zu 63 Merkmalen im Blut, die für maschinelles Lernen verwendet werden, wurden aus klinischen Informationen gesammelt, darunter 37 biochemische Blutmerkmale, 24 routinemäßige Blutmerkmale und zwei Tumorbiomarker. Allgemeine Daten der 635 Patienten im Kreuzvalidierungssatz und im externen Validierungssatz sind in Tabelle 1 aufgeführt, und die detaillierten Informationen sind in der Zusatzdatei 2: Tabelle S1 aufgeführt.

Die aus dem Gallengang gesammelte Galle wurde hauptsächlich während der ERCP, PTC oder Operation gewonnen. Keiner der Krebspatienten erhielt vor dem Cholangiographie-Eingriff oder der chirurgischen Behandlung eine Chemotherapie. Ungefähr 1 bis 6 ml Galle (durchschnittlich 3 ml) wurden gesammelt und jedes Mal in ein steriles Röhrchen überführt. Gallen- und Serumproben wurden unmittelbar nach der Entnahme auf Eis versandt, gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation bei 3000 × g und 4 °C. Die Überstände wurden geerntet und bis zum Test bei –80 °C gelagert.

Kurz gesagt, Proteine ​​in der Galle und im Zellüberstand wurden extrahiert und mit dem Brandford-Test quantifiziert, gefolgt von Alkylierung und enzymatischer Verdauung. Die tryptisch verdauten Peptide der Galle wurden dann mit dem iTRAQ-Reagenzienkit gemäß dem Protokoll des Herstellers markiert, jedoch nicht mit tryptisch verdauten Peptiden des Zellüberstands. Anschließend wurden die verarbeiteten Peptide der Galle und des Zellüberstands durch Off-Gel-Trennung und Nano-LC-MS/MS-Analyse durchgeführt. Für die LC-MS/MS-Analyse wurde ein EASY-Nlc 1000-Nanoflow-LC-Instrument verwendet, das an ein hochauflösendes Massenspektrometer (Q Exactive Plus, Thermo Fisher Scientific) gekoppelt war. Die Probe wurde in eine Tunnelfrittenfallensäule injiziert und die Analyten eingefangen wurden dann durch eine analytische Säule getrennt, und die getrennten Peptide wurden dann identifiziert und aufgrund ihrer elektrischen Ladung für die datenabhängige Erfassung ausgewählt. Nach Erhalt dieser Versuchsdaten wurden die Rohdateien von MaxQuant (Version 1.6) analysiert und dann im Vergleich zu denen in der Swiss-Prot-Datenbank für menschliche Proteinsequenzen (aktualisiert am 02/2019, 20.413 Proteinsequenzen) als entsprechende Proteine ​​identifiziert. Die Falscherkennungsrate von Proteinen lag sowohl auf Protein- als auch auf Peptidebene bei weniger als 1 % (FDR < 1 %), und es wurden mindestens zwei Peptide für die weitere Datenverarbeitung identifiziert.

Die Proteine ​​in der Galle wurden durch Acetonfällung extrahiert. Die Proteinlösung wurde dann durch SDS/PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran übertragen und über Nacht bei 4 °C mit Kaninchen-Anti-CLU-Antikörpern (1:1000, Cell Signaling) oder Maus-Anti-GAPDH (1:2000, Proteintech) inkubiert. . Die Membran wurde später mit einem sekundären Ziegen-Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (1:2000, Cell Signaling) inkubiert und dann mit Chemilumineszenz-Detektion sichtbar gemacht. Die RT-PCR wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des qRT-PCR-Kits (Thermo, USA) durchgeführt. Die Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer für CLU waren 5'-GAGCAGCTGAACGAGCAGTTT-3' bzw. 5'-CTTCGCCTTGCGTGAGGT-3'; wohingegen für GAPDH der Vorwärtsprimer 5'-CCATCACCAT CTTCCAGG-3' und der Rückwärtsprimer 5'-ATGAGTCCTTCCACGATAC-3' war. Die relativen Expressionsniveaus von CLU-mRNA wurden mit GAPDH unter Verwendung des 2−ΔΔCt-Werts verglichen. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt.

Ein Cholangiokarzinom-TMA-Objektträger (enthält 90 CCA-Gewebe und 31 interlobuläre Gallengangsgewebe) wurde von Shanghai Outdo Biotech Co. Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Für die IHC-Färbung wurden ein Immunochemical Staining Kit (MXB, KIT-5002) und Kaninchen-Anti-CLU-Antikörper (1:400, Cell Signaling) verwendet. Die Bilder wurden mit der Software Image pro plus 6.0 analysiert. Die Expressionsintensität von CLU wurde von zwei leitenden Pathologen unabhängig voneinander beurteilt, ohne dass klinische und pathologische Daten bekannt waren. Die Färbungsintensität wurde in 4 Stufen eingeteilt: 0 stellte eine negative Ausprägung (negativ) dar, 1 stellte eine schwache Ausprägung (schwach) dar, 2 war eine mäßige Ausprägung (moderat) und 3 war eine starke Ausprägung (stark). Schließlich wurden negative, mäßige und schwache Ausdrücke (0–2 Punkte) als niedrige Ausdrücke und starke Ausdrücke (3 Punkte) als hohe Ausdrücke definiert.

Die ELISA-Kits wurden zum Nachweis des CLU-Spiegels (E-TSEL-H0014, Elabscience) und CA19-9 (E-EL-H0637c, Elabscience) in der Galle oder im Serum verwendet. Zuerst werden die Referenzstandard-Arbeitslösung und die Proben zur Mikro-ELISA-Platte gegeben, und dann wird sofort die biotinylierte Nachweis-Ab-Arbeitslösung hinzugefügt und 90 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Dann die Lösung aus jeder Vertiefung absaugen oder dekantieren, Waschpuffer in jede Vertiefung geben und HRP-Konjugat-Arbeitslösung in jede Vertiefung geben, dann 30 Minuten bei 37 °C inkubieren. Nach dem erneuten Waschen Substratreagenz in jede Vertiefung geben und etwa 15–20 Minuten bei 37 °C inkubieren. Geben Sie abschließend eine Stopplösung in jede Vertiefung und bestimmen Sie die optische Dichte (OD-Wert) jeder Vertiefung auf einmal mit einem Mikroplatten-Lesegerät, das auf 450 nm eingestellt ist. Die Galle und das Serum mussten vor dem Test verdünnt werden, und um den CLU-Spiegel zu messen, wurden Galle und Serum 100- bzw. 5000-fach verdünnt; Um den CA199-Spiegel zu messen, wurden Galle und Serum 10.000 bzw. fünffach verdünnt.

Unsere Deep-Learning-Methode gliederte sich im Wesentlichen in drei Schritte: Funktionsauswahl, Training zur Erstellung des besten Diagnosepanels und externe Validierung. Zunächst wurde ein Klassifizierungsvorhersagemodell unter Verwendung der Random-Forest-Methode (RF) im Kreuzvalidierungssatz erstellt. Basierend auf der zehnfachen Kreuzvalidierungsklassifizierungsmethode wurden die Daten von 64 Merkmalen von 376 Patienten in zehn Teile unterteilt, zwei davon wurden für die Testkohorte und acht davon für die Trainingskohorte verwendet. Anschließend wurde die Methode „Least Absolute Shrinkage and Selection Operator“ (LASSO) verwendet, um das beste Diagnosepanel basierend auf dem Kriterium auszuwählen, dass der Vorhersagewert der minimalen Anzahl an hochrangigen Merkmalen mit allen Merkmalen gleich war und der Vorhersagewert überwiegend war bewertet anhand einiger gängiger Metriken wie AUC-Wert, Genauigkeit (ACC), Spezifität und Sensitivität. Abschließend wurde das Deep-Learning-Panel durch einen externen Validierungssatz evaluiert, um eine robuste Klassifizierungsleistung zu erhalten. Random Forest und LASSO wurden in glmnet Version 4.1–3 durchgeführt.

Kontinuierliche Variablen wurden als Median (Interquartilbereich) oder Mittelwert ± SD (Standardabweichung) ausgedrückt und mit dem Mann-Whitney-U-Test oder dem Student-t-Test verglichen. Kategoriale Variablen wurden als Rate ausgedrückt und mit dem Chi-Quadrat-Test miteinander verglichen. Die Expression desselben Proteins in verschiedenen Körperflüssigkeiten wurde durch einen Party-Rang-Summentest verglichen. ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) wurden verwendet, um die diagnostische Leistung von Markern oder Panels zu bewerten und unter Verwendung des Youden-Index Grenzwerte festzulegen. Die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde mit der Trapezmethode berechnet, Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit (ACC) wurden mit standardmäßigen 2 × 2-Kontingenztabellen berechnet und ein größerer Wert stellte eine bessere diagnostische Leistung dar. Die Entscheidungskurvenanalyse (DCA) wurde verwendet, um den diagnostischen Wert verschiedener klinischer Diagnosemodelle oder Marker zu vergleichen. Der t-verteilte stochastische Nachbareinbettungsalgorithmus (tSNE) wurde verwendet, um die Auswirkungen des Diagnosemodells visuell zu bewerten. p-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Alle Analysen wurden mit SPSS Statistics 20, GraphPad Prism Version 7.0 und R Version 4.1.0 (R Foundation for Statistical Computing; http://www.R-project.org) durchgeführt.

Die Proteomik von Galle und Zellüberstand wurde zum Screening von CCA-Kandidaten-Biomarkern verwendet (Abb. 1A). In der Gallenproteomik wurden 1585 Proteine ​​identifiziert und 167 unterschiedlich exprimierte Proteine ​​basierend auf dem Standard der Faltungsänderung ≥ 5,0 oder ≤ 0,2 im Vergleich zwischen CCA und gutartigen Gallenerkrankungen gescreent, darunter 130 hochregulierte Proteine ​​und 37 herunterregulierte Proteine ​​(Abb. 1A). , B und Zusatzdatei 2: Tabelle S2). Die Annotationsanalyse von Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) zeigte, dass diese unterschiedlich exprimierten Proteine ​​hauptsächlich mit der Tumorentstehung und Zell-Zell-Interaktionen, einschließlich Chemokin-Signalweg, Regulierung des apoptotischen Signalwegs usw., zusammenhängen Endozytose (Abb. 1C und Zusatzdatei 1: Abb. S2A).

Identifizierung unterschiedlich exprimierter Proteine ​​in Galle und Zellüberstand. A Das Flussdiagramm des Screenings von CCA-Kandidatenmarkern mittels Gallen- und Zellüberstands-Proteomik. B Die Heatmap unterschiedlich exprimierter Proteine ​​in der Galle von CCA und gutartigen Gallenerkrankungen mittels LC-MS/MS-Analyse; N1–N4 repräsentierte die Galle von vier Patienten mit gutartigen Gallenerkrankungen und T1–T5 repräsentierte die Galle von fünf CCA-Patienten. CA-Akkorddendrogramm der Clusterung der unterschiedlich exprimierten Proteine ​​in der Galle mittels KEGG-Analyse. D Die Heatmap unterschiedlich exprimierter Proteine ​​im Zellüberstand. EA-Akkorddendrogramm der unterschiedlich exprimierten Proteine ​​im Überstand mittels KEGG-Analyse. FA-Venn-Diagramm von 54 co-hochregulierten Proteinen im Überstand von vier CCA-Zelllinien mittels LC-MS/MS-Analyse. G Die fünf co-hochregulierten Proteine ​​sowohl in der Galle als auch im Zellüberstand, ihre Gennamen sind rechts aufgeführt. Das HA-Venn-Diagramm zeigt, dass das CLU-Protein auch in den Proteomikdaten einer anderen externen Gallengruppe hochreguliert war

Für die markierungsfreie quantitative Analyse wurden Zellüberstände von vier CCA-Zelllinien (TFK-1, HuCCT-1, RBE und HCCC-9810) und einer menschlichen intrahepatischen Gallenepithelzelllinie (HIBEpiC) verwendet, insgesamt wurden 932 Proteine ​​gefunden Es wurden unterschiedlich exprimierte Proteine ​​gefunden, darunter 273 hochregulierte Proteine ​​und 659 herunterregulierte Proteine ​​(Abb. 1A, D und Zusatzdatei 2: Tabelle S3). Die GO- und KEGG-Analyse zeigte, dass diese unterschiedlich exprimierten Proteine ​​mit der Signaltransduktion und Immunregulation während der Tumorprogression verbunden waren, einschließlich ECM-Rezeptor-Interaktion, endozytischen Vesikeln und Endozytose (Abb. 1E und Zusatzdatei 1: Abb. S2B).

Im Vergleich zur HIBEpiC-Zelllinie waren in CCA-Zelllinien 54 Proteine ​​erhöht (Abb. 1F). Beim Überschneiden der hochregulierten Proteine ​​in der Galle und im Überstand wurden fünf Proteine ​​herausgesucht (Abb. 1G), darunter CLU, COL6A1, GOLM1, QSOX1 und IGFBP1. Angesichts der begrenzten Anzahl unserer Gallenproben ist ein weiterer Gallenproteomdatensatz aus der Studie von Marut Laohaviroj et al. (externe Galle 1) [13] wurde hinzugefügt. Basierend auf dem Standard einer Faltungsänderung ≥ 1,5 im Vergleich zwischen CCA und Nicht-CCA wurden 63 hochregulierte Proteine ​​in der externen Galle 1 identifiziert, aber nur CLU wurde in der externen Galle 1 unter den fünf Kandidatenproteinen erhöht gefunden (Abb. 1H). Schließlich wurde CLU für weitere Studien ausgewählt.

Der CLU-Spiegel in CCA wurde in klinischen Proben und Zellen überprüft. Zur Überprüfung des Proteingehalts von CLU wurden 16 Gallenproben (8 von CCA und 8 von gutartigen Gallenerkrankungen) entnommen. Wie in Abb. 2A gezeigt, war der Gehalt an CLU-Protein in CCA höher und es gab nur eine geringe oder keine Expression gutartiger Gallenerkrankungen in der Galle. Für die immunhistochemische Färbung wurde ein Gewebe-Microarray (TMA) mit 121 chirurgischen Gewebeproben verwendet, darunter 90 CCA-Gewebe und 31 interlobuläre Gallengangsgewebe (Zusatzdatei 1: Abb. S3). CLU befand sich hauptsächlich im Zytoplasma (Abb. 2B). Von den 90 CCA-Geweben waren 89 CLU-positiv (98,9 %). Die Fälle mit positiver Tumorfärbung wurden dann in schwache, mäßige und starke Expression unterteilt, was zu 4 (4,5 %) Fällen, 36 (40,4 %) Fällen bzw. 49 (55,1 %) Fällen führte. In den 31 interlobulären Gallengangsgeweben gab es 12 (38,7 %) negative Färbungsfälle. Die Analyse immunhistochemischer Bilder zeigte, dass der CLU-Spiegel bei CCA signifikant höher war (p < 0,001) (Abb. 2B). Die Kaplan-Meier-Überlebensanalyse zeigte, dass CCA-Patienten mit hohem CLU-Wert eine kürzere Gesamtüberlebenszeit (OS) (p < 0,0001) und eine kürzere rezidivfreie Überlebenszeit (RFS) (p < 0,001) hatten (Abb. 2C, D). Es gab jedoch keinen Zusammenhang zwischen den CLU-Werten bei CCA-Tumoren und dem TNM-Stadium, Gefäßinvasion, Lymphknotenbefall und Metastasierung (p > 0,05). Insgesamt könnte eine hohe CLU-Expression das Fortschreiten von CCA fördern.

Die Überexpression von CLU in CCA. Eine Immunblotting-Analyse von CLU in der Galle von 8 CCA-Patienten und 8 Patienten mit gutartigen Gallenerkrankungen. B Repräsentative immunhistochemische Bilder und das Ausmaß der CLU-Expression in CCA-Geweben und interlobulären Gallengangsgeweben (normal); Der rote Pfeil zeigt auf den interlobulären Gallengang. C, D Die Kurven für das Gesamtüberleben (OS) und das rezidivfreie Überleben (RFS) von CLU bei CCA; Das Blau steht für einen geringen Ausdruck und das Orange für einen hohen Ausdruck. E, F Immunblotting-Analyse von CLU in Zellen und Zellüberständen von vier CCA-Zelllinien und der HIBEpiC-Zelllinie. G Der mRNA-Spiegel von CLU in vier CCA-Zelllinien und der HIBEpiC-Zelllinie. H, I Immunblotting-Analyse von CLU in Zellen und Zellüberständen von fünf primären CCA-Zellen und HIBEpiC-Zellen. J Der mRNA-Spiegel von CLU in fünf primären CCA-Zellen und HIBEpiC-Zellen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001

Wie in Abb. 2E–G gezeigt, waren die Spiegel an CLU-Protein und mRNA in vier CCA-Zelllinien stark exprimiert (p <0,05). Wir haben erfolgreich fünf primäre CCA-Zellen aus postoperativen Geweben extrahiert, in denen auch CLU überexprimiert war (Abb. 2H – J).

Um mögliche Marker zwischen Gallen-CLU und Serum-CLU zu überprüfen, wurden 40 Fälle von Galle und Blut von Patienten mit CCA oder gutartigen Gallenerkrankungen und 40 Fälle von Blut von gesunden Spendern für Pilotstudien gesammelt (Abb. 3A). Wie in Abb. 3B, C gezeigt, war die Häufigkeit von CLU im Serum und in der Galle bei CCA im Vergleich zur Kontrollgruppe höher. Die Häufigkeit von CLU im Serum war besonders hoch und lag selbst bei gesunden Spendern im Mittel bei 94.251,6 (83.887,5, 107.707,6) ng/ml. Allerdings betrug der Median der Gallen-CLU selbst bei CCA nur 154,6 (73,7, 5945,9) ng/ml (Zusatzdatei 2: Tabelle S4) und war damit deutlich niedriger als die Werte im Blut (p < 0,001). Hochabundante Proteine ​​sind aufgrund ihrer geringen Sensitivität nicht als diagnostische Marker geeignet [4]. Daher wurde Galle-CLU als zufriedenstellender diagnostischer Biomarker für CCA identifiziert.

ELISA-Assay und ROC-Analyse von CLU oder CA19-9 in Galle und Serum. AA-Zusammenfassung der Patientenkohorte, die für die Pilotstudie zu CLU verwendet wurde. B ELISA-Analyse von CLU im Serum von 40 CCA-Patienten, 40 Patienten mit gutartigen Gallenerkrankungen und 40 gesunden Spendern. C ELISA-Analyse von CLU in der Galle von 40 CCA-Patienten und 40 Patienten mit gutartigen Gallenerkrankungen. DA-Zusammenfassung der Patientenkohorte, die für die Pilotstudie von CA19-9 verwendet wurde. E, F ELISA-Analyse von CA19-9 im Serum und in der Galle von 40 CCA-Patienten und 40 Patienten mit gutartigen Gallenerkrankungen. GA-Zusammenfassung der Patientenkohorte im Kreuzvalidierungssatz. H, I ELISA-Analyse von Gallen-CLU und Serum-CA19-9 von 144 CCA-Patienten und 232 Nicht-CCA-Patienten. J Die ROC-Kurven von Gallen-CLU, Serum-CA19-9 und CLU&CA19-9; die blaue Kurve stellt CLU dar, die grüne Kurve stellt CA19-9 dar und die rote Kurve stellt CLU&CA19-9 dar; Die Daten bedeuten AUC (95 % KI). K Die Genauigkeit (ACC), Sensitivität und Spezifität von Galle CLU, Serum CA19-9 und CLU&CA19-9. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001

CA19-9 kommt sowohl im Serum als auch in der Galle vor (Abb. 3D). Wie in Abb. 3E, F gezeigt, war der CA19-9-Spiegel in der Galle oder im Serum bei CCA höher. In der Gruppe mit CCA und gutartigen Gallenerkrankungen betrug der Median in der Galle 280.276,9 (130.513,2, 906.704,6) IU/ml bzw. 177.343,8 (65.142,4, 476.812,0) IU/ml, im Serum betrug er jedoch 81,1 (37,0, 389,0). ) IU /ml bzw. 23,4 (9,0, 59,9) IE/ml (Zusatzdatei 2: Tabelle S4), deutlich niedriger als die Werte in der Galle (p < 0,001). Ebenso eignete sich CA19-9 im Serum besser als diagnostischer Biomarker für CCA.

Danach wurden insgesamt 376 Patienten zur weiteren Untersuchung in den Kreuzvalidierungssatz aufgenommen (Abb. 3G). Wie in Abb. 3H, J gezeigt, war die Häufigkeit von Gallen-CLU bei CCA höher und die ROC-Analyse zeigte eine zufriedenstellende diagnostische Kapazität mit einer AUC von 0,852 (95 %-KI 0,806 bis 0,899) (Sensitivität 73,6 %, Spezifität 90,1 %). ). Die Gallen-CLU bei CCA war signifikant höher als bei gutartigen Gallenerkrankungen und Nicht-CCA-Krebserkrankungen, und es gab auch keinen statistischen Unterschied in der Gallen-CLU-Konzentration zwischen malignen Kontrollen und nicht-malignen Kontrollen (p = 0,23) (Zusatzdatei 1: Abb. S4A ), und es gab keine Korrelation zwischen dem Gallen-CLU-Spiegel und dem Alter (p = 0,60) oder den Tumorstadien bei Patienten mit CCA (rs = – 0,104, p = 0,260) (Zusatzdatei 1: Abb. S4B). Beim Vergleich der Gallen-CLU-Werte zwischen Patienten mit chronischen Gallenwegserkrankungen und Patienten mit nichtchronischen Gallenwegserkrankungen wurde kein statistischer Unterschied zwischen ihnen festgestellt (Zusatzdatei 1: Abb. S4C). Darüber hinaus gab es keinen Unterschied im Gallen-CLU-Spiegel zwischen Lithiasis-assoziierten CCA-Patienten (n = 20) und Einzel-CCA-Patienten (p = 0,26), aber ein signifikanter Unterschied wurde zwischen Lithiasis-assoziierten CCA-Patienten und Cholangiolithiasis-Patienten gefunden (p < 0,001)( Zusatzdatei 1: Abb. S4D). Die obigen Ergebnisse zeigten, dass es keinen Zusammenhang zwischen den CLU-Konzentrationen in der Galle und chronischen Erkrankungen der Gallenwege gab.

Die Häufigkeit von Serum-CA19-9 war bei CCA höher und sein AUC-Wert betrug 0,783 (95 %-KI 0,735 bis 0,830) (Sensitivität 84,7 %, Spezifität 66,8 %) (Abb. 3I, J). Aufgrund der Tatsache, dass Gallen-CLU eine hohe Spezifität und eine geringe Sensitivität aufwies, während CA19-9 genau das Gegenteil war, erwägen wir die Etablierung eines Modells, das Gallen-CLU und Serum-CA19-9 enthält, um eine bessere Genauigkeit zu erzielen. Wie in Abb. 3J dargestellt, stieg der diagnostische Wert im CLU&CA19-9-Modell mit einer AUC von 0,891 (95 %-KI 0,855 bis 0,928) deutlich an, viel höher als bei den beiden einzelnen Mitgliedern. Seine Sensitivität und Spezifität wurden beide auf 84,0 % bzw. 81,9 % verbessert (Abb. 3K) (Zusatzdatei 3: Tabelle S5), was auf eine bessere diagnostische Leistung hinweist.

Die diagnostische Leistung eines Biomarkers kann durch die Kombination mit verschiedenen Arten zirkulierender Biomarker verbessert werden. Die für maschinelles Lernen verwendeten Daten jedes Patienten enthielten Gallen-CLU und 63 Serummerkmale. Im Kreuzvalidierungssatz wurden die 30 wichtigsten Merkmale nach ihrer Genauigkeit (links) und ihrem Gini-Index (rechts) durch Random Forest (RF) (Abb. 4A) sowie CLU, CA19-9 und Bilirubin herausgesucht hat am meisten zum HF-Modell beigetragen. Ihre diagnostischen Werte wurden durch ROC-Analyse identifiziert (Zusatzdatei 3: Tabelle S6), und nur die Top-10-Merkmale wiesen zufriedenstellende AUC-Werte auf, einschließlich CLU, CA19-9, DBIL, IBIL, ALP, TBIL, GGT, TG, LDLC und TBA. Eine geringe Korrelation zwischen verschiedenen Biomarkern könnte den Inhalt der Nachricht verbessern und die diagnostische Leistung verbessern [14]. Die Korrelationsmatrix zwischen den 10 Markern zeigte, dass eine hohe Korrelation zwischen TBIL, DBIL und IBIL bestand (r > 0,5, p < 0,001), was durch ihre klinische Beziehung erklärt werden konnte, ähnlich dem gleichen Prinzip, das auch auf die hohe Korrelation angewendet wurde zwischen GGT und ALP (r > 0,5, p < 0,001) (Abb. 4B). Die anderen Marker wiesen untereinander geringe Korrelationen auf (p < 0,05).

Die Entwicklung des Diagnosepanels durch maschinelles Lernen. A Die 30 am höchsten bewerteten Features wurden mit einem Zufallswaldmodell überprüft und nach Genauigkeit (links) und Gini-Index (rechts) eingestuft. Die Merkmale weiter oben rechts waren wichtiger. B Die Korrelationsmatrix zwischen den Top-10-Merkmalen, einschließlich CLU, CA19-9, DBIL, IBIL, ALP, TBIL, GGT, TG, LDLC und TBA; Die Zahlen stellen den Korrelationskoeffizienten (r) zwischen den beiden Merkmalen dar. C ROC-Kurven des Sieben-Panels und seiner Mitglieder; Die Daten bedeuten AUC (95 % KI). D tSNE-Analyse des Sieben-Panels; Das Blau steht für CCA und das Rosa für Nicht-Tumor. E Die DCA-Analyse des Sieben-Panels, CLU und CA19-9; Grün steht für CA19-9, Blau steht für CLU und Rot steht für das Siebenfeld. F ROC-Kurve des Sieben-Panels im externen Validierungssatz; Die Daten bedeuten AUC (95 % KI). AUC ist die Fläche unter der Kurve. r ≥ 0,8 bedeutet hohe Korrelation, 0,5 ≤ r < 0,8 bedeutet starke Korrelation, 0,3 ≤ r < 0,5 bedeutet schwache Korrelation und r < 0,3 bedeutet keine Korrelation

Eine optimale Auswahl der Anzahl der Merkmale ist entscheidend für die Erstellung eines Klassifizierungsmodells. Basierend auf den zehn ausgewählten Markern wurde die LASSO-Methode angewendet, um ein optimales Klassifizierungsmodell zu erstellen (Zusatzdatei 1: Abb. S5A). Schließlich wurde das Sieben-Panel als optimales Diagnosemodell identifiziert, einschließlich CLU, CA19-9, IBIL, GGT, TG, LDLC und TBA, und es gab nur eine geringe oder keine Korrelation (r < 0,5) zwischen den sieben Biomarkern ( Abb. 4B). Wie in Abb. 4C gezeigt, hatte das Sieben-Panel-Modell einen viel höheren AUC-Wert (AUC: 0,947, 95 %-KI: 0,925 bis 0,968) und sowohl seine Sensitivität als auch seine Spezifität wurden auf 90,3 % und 84,9 % verbessert, was auf eine hervorragende Leistung hindeutet diagnostische Genauigkeit (ACC von 87,0 %) (Zusatzdatei 3: Tabelle S5), und das Sieben-Panel-Modell hatte keine Korrelation mit dem TNM-Stadium (p = 0,410), Lymphknotenmetastasierung (p = 0,537) und Fernmetastasierung (p = 0,537).

Der tSNE-Algorithmus wurde verwendet, um die komplexe Verwirrungsmatrix zu vereinfachen, die uns helfen kann, die Verteilung von Krankheiten zu visualisieren und intuitiv zu verstehen. Das tSNE-Ergebnis des Sieben-Panels zeigte, dass die CCA-Gruppe und die Kontrollgruppe unterschiedliche Cluster bildeten (Abb. 4D), was darauf hinweist, dass das Sieben-Panel auch unter Visualisierungsbedingungen CCA gut unterscheiden konnte. Die Entscheidungskurvenanalyse (DCA) wurde verwendet, um die klinische Leistung von CLU, CA19-9 und dem sieben Panel zu beobachten. Das Ergebnis zeigte, dass das sieben Panel einen größeren klinischen Gesamtnutzen bei der Differenzierung von CCA erzielte (Abb. 4E).

Um die Stabilität und Zuverlässigkeit des Sieben-Panel-Modells weiter zu bewerten, haben wir es auf einen unabhängigen externen Validierungssatz von 259 Patienten angewendet, darunter 87 Patienten mit CCA und 172 Patienten mit Nicht-CCA-Erkrankungen (Tabelle 1). Im externen Validierungssatz zeigte das sieben Panel eine zufriedenstellende Vorhersagefähigkeit mit einer AUC von 0,925 (Abb. 4F) und erreichte eine Sensitivität von 87,4 % und eine Spezifität von 83,7 % (Zusatzdatei 3: Tabelle S5). Die tSNE- und DCA-Analyse zeigte ebenfalls eine perfekte Diagnoseleistung (Zusatzdatei 1: Abb. S5B und 5C). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das sieben Gremium CCA genau diagnostizieren und den tatsächlichen Anforderungen der klinischen Entscheidungsfindung gerecht werden kann.

Um die Verwendung dieses Modells in der klinischen Praxis zu erleichtern, haben wir ein benutzerfreundliches Online-Modell auf der China Prediction Platform of Digital Disease (CPPDD) eingerichtet (verfügbar unter: http://cppdd.cn/CCA/). Benutzer müssen lediglich die spezifischen Werte der sieben Biomarker eingeben und dann auf die Schaltfläche „Senden“ klicken (Abb. 5). Nach der Berechnung würde das Modell mit einer prozentualen Wahrscheinlichkeit eine Schlussfolgerung darüber liefern, ob dieser Patient CCA hat oder nicht. Benutzer sollten die Einheiten noch einmal überprüfen, um korrekte Ergebnisse sicherzustellen.

Die Diagnose-Website von CCA. A Patienten mit Erkrankungen der Gallenwege suchen medizinische Hilfe. B Einfache Weboberfläche zur Eingabe des Wertes der sieben Marker. C Die Ergebnisseite der Online-Website; Das CCA-Risiko wurde als prozentuale Wahrscheinlichkeit ausgedrückt

In dieser Studie haben wir durch Proteomik auf innovative Weise einen neuartigen diagnostischen Biomarker CLU für CCA entdeckt. Um die diagnostische Genauigkeit zu verbessern, wurde mithilfe von Deep-Learning-Algorithmen ein Diagnosemodell entwickelt, das aus Gallen- und Serumbiomarkern besteht (Abb. 6). Dies ist bisher die größte und umfassendste Studie, die Gallen- und Serumbiomarker zur Differenzierung von CCA kombiniert.

Der Gesamtablauf der Einrichtung eines Sieben-Panel-Modells und einer Online-Vorhersageplattform für CCA

Die genaue Diagnose von CCA war schon immer ein großer Aufwand und die Suche nach neuen Diagnosemethoden ist dringend erforderlich. Die hohe Heterogenität von CCA kann zu ungenauen Ergebnissen primärtumorbasierter Proteomik führen, aber Körperflüssigkeiten, die globale Veränderungen im pathophysiologischen Status widerspiegeln, sind eine hervorragende Quelle für die Suche nach neuen und zuverlässigen diagnostischen Markern [15]. Darüber hinaus sind Proteine ​​in der Galle reichlich vorhanden und relativ leicht nachzuweisen, sodass sich die Identifizierung der unterschiedlich exprimierten Proteine ​​in der Galle als gute Strategie für die Suche nach neuen diagnostischen Biomarkern erwies.

Während der Entdeckungsphase wurden in der Gallenproteomik insgesamt 1585 Proteine ​​identifiziert, viel mehr als in früheren Studien [16,17,18]. Diese unterschiedlich exprimierten Proteine ​​waren hauptsächlich mit der Tumorentstehung verbunden, was auf eine Spezifität für CCA hinweist. Um zu bestätigen, dass die Differenzproteine ​​in der Galle tatsächlich von Tumorzellen und nicht von Entzündungszellen oder anderen Zellen sezerniert wurden, führten wir eine Proteomik des Überstands von CCA-Zellen und HIBEpiC durch. Angesichts der Einschränkungen von Single-Center-Studien haben wir Gallenproteomik zitiert Daten aus einer anderen Studie [13]. Schließlich zeigte die Analyse von drei proteomischen Daten, dass Protein CLU der am besten geeignete Biomarker für CCA war.

Clusterin (CLU) ist ein stressaktiviertes, ATP-unabhängiges molekulares Chaperon, das normalerweise von Zellen ausgeschieden wird und die Krebsentstehung fördern kann, indem es die Zellproliferation, Apoptose und den Zyklus reguliert. Es ist bei mehreren Krebsarten stark ausgeprägt, darunter Speiseröhren-, Prostata- und Brustkrebs [19, 20]. Obwohl Li et al. führten die Immunhistochemie von CLU in 13 Fällen von CCA-Geweben durch, führten keine weiteren Studien durch [21] und diese Studie war die erste, die ihre diagnostischen Fähigkeiten bei CCA eingehend und umfassend untersuchte. In dieser Studie wurde die Überexpression von CLU in CCA in Zelllinien, Primärzellen und klinischen Proben festgestellt. Wir fanden auch eine enge Korrelation zwischen CLU- und CCA-Prognose. Derzeit ist CA19-9 der in der klinischen Praxis am häufigsten verwendete diagnostische Marker für Cholangiokarzinome, obwohl seine diagnostische Wirkung mäßig ist [22].

Frühere Studien haben darauf hingewiesen, dass Serum-CLU zur Krebsdiagnose verwendet werden kann [23, 24]. Bevor der diagnostische Nutzen von CLU für CCA überprüft wurde, wurden Pilotstudien durchgeführt, um das Ausmaß seiner Expression in verschiedenen Arten von Proben zu ermitteln. Die Ergebnisse zeigten, dass CLU im Serum besonders bemerkenswert war, während die Häufigkeit in der Galle relativ gering war. Der wahrscheinlichste Grund dafür ist, dass CLU nicht nur in Cholangiozyten, sondern auch von anderen Organen wie Gehirn, Herz, Leber, Lunge und Prostata ins Serum sezerniert wird [25, 26]. Allerdings sind Proteine ​​mit hoher Häufigkeit für die Diagnose weniger empfindlich, Proteine ​​mit geringer Häufigkeit sind genau das Gegenteil [4]. Daher wurde Galle-CLU als potenzieller diagnostischer Marker für CCA ausgewählt. CLU ist ein sezerniertes Protein, das von Geweben in Körperflüssigkeiten sezerniert werden kann [27], und diese Studie zeigt, dass CLU in CCA-Geweben überexprimiert wird; Darüber hinaus ist Galle die an CCA-Gewebe angrenzende Körperflüssigkeit, so dass die erhöhten Gallen-CLU-Konzentrationen bei CCA-Patienten möglicherweise aus den Krebsgeweben ausgeschieden werden. Mehrere proteomische Studien fanden eine Reihe unterschiedlich exprimierter Proteine, die für CCA in der Galle spezifisch sind, wie Mac-2BP, SSP411 und AAT, allerdings aufgrund ihrer geringen Validierungskohortengröße (26 bis 54 CCA-Probanden) und der Verwendung nur eines einzigen Markers , ihre diagnostischen Fähigkeiten waren eingeschränkt [13, 28, 29]. In unsere Studie wurden insgesamt 644 Probanden aufgenommen, um den diagnostischen Wert von Gallen-CLU und Serum-CA19-9 zu ermitteln. Die ROC-Analyse zeigte, dass Gallen-CLU der diagnostischen Kapazität von CA19.9 deutlich überlegen war (DeLong-Test, p < 0,05). ). CLU hatte eine gute Spezifität, aber keine Sensitivität, während CA19-9 aufgrund seiner hohen Expression bei einigen gutartigen Gallenerkrankungen genau das Gegenteil aufwies. Aber die Kombination zu einem Panel verbesserte den diagnostischen Wert für CCA, und es gab 33 CCA-Patienten mit Lewis-Antigen-negativ (CA19-9 < 40 IU/ml), von denen 81,8 % (27 Patienten) einen erhöhten CLU der Gallenflüssigkeit aufwiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die diagnostische Aussagekraft zweier sich gegenseitig kompensierender Indikatoren durch ihre Kombination deutlich verbessert werden kann.

Während der Entstehung von CCA veränderten sich verschiedene Indikatoren im Blut, wie z. B. Transaminasen und Bilirubin, ihnen fehlt jedoch die CCA-Spezifität und sie sind auch bei anderen Gallenerkrankungen in ähnlicher Weise verändert [30]. Jeder Biomarker im Blut und in der Galle spiegelt die einzigartigen Eigenschaften des Patienten wider, und wir vermuteten, dass die Kombination mehrerer verschiedener Arten von Biomarkern zu einem besseren Diagnoseinstrument führen könnte. Deep Learning wird immer verwendet, um logische Muster durch die Analyse von Massendaten mit mathematischen Algorithmen zu lernen und Vorhersagemodelle zu erstellen. In den letzten Jahren wurde Deep Learning in Krebsdiagnose- und Prognosevorhersagemodellen häufig eingesetzt und es wurde festgestellt, dass es die Genauigkeit der Krebsrezidiv- und Überlebensvorhersage verbessert [31]. In dieser Arbeit wurde Deep Learning verwendet, um ein Diagnosemodell zu erstellen, das aus Gallen-CLU und anderen Serummarkern besteht.

Um ein Multimarker-Diagnosepanel zu erstellen, sollte jeder Marker diagnostisch aussagekräftig sein und nicht miteinander korrelieren, um sicherzustellen, dass jeder Marker eindeutige Informationen über das Stadium des Patienten besitzt [32]. Basierend auf den oben genannten Kriterien wurde ein Sieben-Panel-Modell aus 64 Markern im Kreuzvalidierungssatz durch Random Forest und die LASSO-Methode erstellt. Im Vergleich zu seinen einzelnen Komponenten war die Diagnosekapazität des generierten Modells deutlich verbessert (DeLong-Test, p < 0,05), und im Vergleich zur Kombination von CLU und CA19-9 hatte das Sieben-Panel eine bessere Vorhersagekraft mit zunehmender AUC von 0,891 bis 0,947 (Zusatzdatei 3: Tabelle S5). Als derzeit beste Dimensionsreduktionsvisualisierung kann tSNE uns dabei helfen, die Ausbreitung der Krankheit zu visualisieren und intuitiv zu verstehen [14]. Der tSNE-Algorithmus zeigte, dass das Sieben-Panel CCA visuell effektiv unterscheiden konnte, was darauf hindeutet, dass der tSNE-Algorithmus auf die Visualisierungsausgabe des Diagnosemodells von CCA angewendet werden kann. Die Vorhersagekraft des Sieben-Panel-Modells wurde dann in einem externen Validierungssatz validiert, der völlig unabhängig vom Modellierungsprozess war.

Das Vorhersagemodell enthielt sieben Marker, darunter Gallen-CLU, CA19-9, indirektes Bilirubin (IBIL), Gamma-Glutamyltransferase (GGT), Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin (LDL-C), Triglycerid (TG) und Gesamtgallensäure ( TBA). Serumbilirubin umfasst hauptsächlich direktes Bilirubin (DBIL), indirektes Bilirubin (IBIL) und Gesamtbilirubin (TBIL), und sie sind häufig aufgrund einer Leberfunktionsstörung oder einer Gallenstauung erhöht [33]. Gamma-Glutamyltransferase (GGT) ist ein Enzym des Glutathion- und Cysteinstoffwechsels und der Standardtest für Leberenzyme, der Cholestase und Gallengangsobstruktion widerspiegelt [34]. Gesamtgallensäuren (TBA) sind das Endprodukt des Cholesterinstoffwechsels in der Leber und nehmen bei hepatozellulären Läsionen oder Gallenstauungen immer zu [35]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass GGT, IBIL und TBA Gallenstrikturen widerspiegelten und während der CCA-Entwicklung immer zunahmen [36, 37]. LDL-C stand hauptsächlich mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Zusammenhang, in einer prospektiven Kohortenstudie wurde jedoch festgestellt, dass die LDL-C-Werte eng mit der Krebssterblichkeit verbunden sind, was möglicherweise auf den Cholesterinspiegel zurückzuführen ist [38]. Cholesterin und seine Metaboliten spielen eine wichtige Rolle in der Tumorbiologie, insbesondere in onkogenen Signalwegen, Ferroptose und der Tumormikroumgebung [39]. Die Ansammlung von Lipiden kann das Fortschreiten des Tumors über AMP-Kinase- und mTOR-Signale verschlimmern, und TG spielt in diesem Signalweg eine unersetzliche Rolle [40, 41]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die sieben Biomarker eng mit der Krebsentstehung zusammenhängen.

Es gibt viele Methoden, um CCA von gutartigen Gallenstrikturen zu unterscheiden, aber ihre Ergebnisse sind frustrierend (Zusatzdatei 3: Tabelle S7). Endoskopische retrograde Cholangiopankreatographie (ERCP), Durchleuchtung mit Bürstenzytologie (ERCP-BC) (und/oder Zangenbiopsie) oder Feinnadelaspiration (FNA) ist die primäre Probenahmetechnik zur Identifizierung von CCA, ihre Vorhersagewerte sind jedoch schlecht (gepoolte Sensitivität von 6–65). %) werden häufig durch eine unzureichende Menge an Gewebeproben sowie durch die unzureichende Lage und Größe der Läsion erschwert [5, 42]. Für die CCA-Diagnose wurden auch Serumproteine ​​wie fucosyliertes Fetuin-A, CA50 und MMP-7 verwendet (gepoolte Sensitivität 55,3–75 %, Spezifität 78–90 %) [43,44,45]. Die extrazellulären Vesikel in der Galle und im Serum wurden ebenfalls für die CCA-Diagnose verwendet, allerdings mit einem schlechten AUC-Wert (0,696–0,759) [46, 47]. In letzter Zeit wurden auch Proteine ​​und Nukleinsäuren in der Galle für die CCA-Diagnose verwendet, wie z. B. verringerte Gesamtgallensäuren, Protein CMA1 und MCM-5, ihre Sensitivität oder Spezifität war jedoch gering [48, 49]. Bei den nicht-invasiven Methoden könnten auch Proteine ​​und Exosomen im Urin zur Unterscheidung von CCA mit einem AUC-Wert von 0,68–0,82 verwendet werden [50, 51]. Im Gegensatz dazu könnte unsere Methode CCA besser unterscheiden und eine diagnostische Option für Patienten bieten, die möglicherweise nicht an einer Operation interessiert sind, und gleichzeitig das derzeit verfügbare CCA-Bewertungstool ergänzen.

CCA ist ein sich schnell entwickelnder Tumor und die Technik der Gallensammlung ist äußerst anspruchsvoll. In vielen Studien konnte nur eine kleine Kohortengröße eingeschlossen werden, während wir eine große Anzahl von Gallenproben aus zwei Zentren sammelten. Darüber hinaus ist dies die erste Studie, die Deep Learning nutzt, um Gallen- und Serummarker für die CCA-Diagnose zu kombinieren. Schließlich wurde für die weitere Anwendung online eine benutzerfreundliche Vorhersageplattform für CCA eingerichtet.

Es gab auch einige Einschränkungen in unserer Studie. Bei dieser Studienpopulation handelt es sich ausschließlich um Chinesen. Es wird eine größere Kohortenstudie mit Patienten mit CCA oder gutartigen Gallenerkrankungen aus mehreren medizinischen Zentren durchgeführt, um die diagnostische Leistungsfähigkeit dieses Diagnosemodells vollständig zu überprüfen und eine frühzeitige Anwendung in der klinischen Diagnose anzustreben. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass es schwierig ist, Galle zu sammeln, da ERCP und andere damit verbundene chirurgische Eingriffe nicht in allen medizinischen Einrichtungen verfügbar sind. Glücklicherweise sind diese Techniken in den letzten Jahren jedoch immer bekannter geworden. Darüber hinaus wurde der onkogene Mechanismus von CLU bei CCA nicht aufgeklärt; Daher sind Zell- und Tierversuche erforderlich, um es im späteren Stadium zu erforschen.

Nach unserem besten Wissen ist dies die größte und umfassendste Studie, in der verschiedene Körperflüssigkeits-Biomarker zur effizienten Unterscheidung von CCA eingesetzt werden. In dieser Studie wurde ein Multimarker-Diagnosepanel für CCA erstellt, das eine Erkennungs-, Verifizierungs- und Validierungspipeline nutzt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass das Sieben-Panel-Modell eine vielversprechende Methode zur Vorhersage des Auftretens von CCA wäre.

Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das iProX-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD043745 an das ProteomeXchange-Konsortium übermittelt.

Genauigkeit

Fläche unter der Kurve

Kohlenhydratantigen 19–9

Gallengang

Cholangiokarzinom

Cluster

Direktes Bilirubin

Entscheidungskurvenanalyse

Endoskopische retrograde Cholangiopankreatographie

Gamma-Glutamyltransferase

Intrahepatischer Gallengang

Indirektes Bilirubin

Lipoprotein-Cholesterin niedriger Dichte

Perkutane transhepatische Cholangiographie

Zufälliger Wald

Gesamtgallensäure

Gesamt-Bilirubin

Triglycerid

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Keane MG, Huggett MT, Chapman MH, Johnson GJ, Webster GJ, Thorburn D, et al. Diagnose einer malignen Erkrankung der Bauchspeicheldrüse durch Nachweis des Minichromosom-Erhaltungsproteins 5 in der Gallenbürstenzytologie. Br J Krebs. 2017;116(3):349–55.

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Voigtländer T, Metzger J, Schönemeier B, Jäger M, Mischak H, Manns MP, et al. Ein kombinierter Gallen- und Urin-Proteomtest zur Diagnose eines Cholangiokarzinoms bei Patienten mit Gallenstrikturen unbekannter Ursache. United European Gastroenterol J. 2017;5(5):668–76.

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Silakit R, Loilome W, Yongvanit P, Thongchot S, Sithithaworn P, Boonmars T, et al. Urin-microRNA-192 und microRNA-21 als potenzielle Indikatoren für die Risikogruppe eines Leberegel-assoziierten Cholangiokarzinoms. Parasitol Int. 2017;66(4):479–85.

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Referenzen herunterladen

Wir möchten Dr. Banchob Sripa (Abteilung für Pathologie, Fakultät für Medizin, Khon Kaen-Universität) für die Hilfe bei der Gallenproteomik danken.

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (82060551), dem Key Talent Program der Provinz Gansu (2019RCXM077) und dem Health Industry Scientific Research Program der Provinz Gansu (GSWSKY2020-11) unterstützt.

Long Gao, Yanyan Lin, Ping Yue und Shuyan Li haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Die erste Schule für klinische Medizin, Lanzhou University, Lanzhou, 730030, Gansu, China

Long Gao, Yanyan Lin, Ping Yue, Yong Zhang, Ningning Mi, Mingzhen Bai, Wenkang Fu, Zhili Xia, Ningzu Jiang, Jie Cao, Yanni Ma, Fanxiang Zhang, Chao Zhang, Wenbo Meng und Xun Li

Abteilung für Allgemeine Chirurgie, Erstes Krankenhaus der Universität Lanzhou, Lanzhou, 730030, Gansu, China

Long Gao, Yanyan Lin, Ping Yue, Yong Zhang, Ningning Mi, Mingzhen Bai, Wenkang Fu, Zhili Xia, Ningzu Jiang, Wenbo Meng und Xun Li

Schlüssellabor für biologische Therapie und Transformation der regenerativen Medizin der Provinz Gansu, Lanzhou, 730030, Gansu, China

Yanyan Lin, Ping Yue, Yong Zhang, Wenbo Meng und Xun Li

School of Medical Information and Engineering, Xuzhou Medical University, Xuzhou, 221004, Jiangsu, China

Shuyan Li

Klinisches Forschungszentrum, Big Data Center, The Seventh Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Shenzhen, 518107, Guangdong, China

Man Yang & Jinqiu Yuan

Abteilung für Gastroenterologie, UC Davis Medical Center und Sacramento VA Medical Center, Sacramento, CA, 95817, USA

Joseph W. Leung

Abteilung für Endoskopie, Nationales Krebszentrum/Nationales Klinisches Forschungszentrum für Krebs/Krebskrankenhaus, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften und Peking Union Medical College, Peking, China

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LG, YYL, SH und WBM: Studienkonzeption und Design. LG, PY, YZ, MZB, NZJ, JC, YNM, FXZ, MY, CZ und SH: Sammlung von Proben und Daten. LG, NNM, ZLX, SYL und JQY: Analyse und Interpretation der Daten. LG, YYL, WKF, JQY und WBM: Verfassen und Überarbeiten des Manuskripts. PY, JWL, WBM und XL: technische oder materielle Unterstützung. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Shun He, Jinqiu Yuan oder Wenbo Meng.

Diese Studie wurde von der Human Research Ethics Committee des First Hospital of Lanzhou University (LDYYLL2022-381) mit Ausnahme der Einwilligung nach Aufklärung genehmigt und in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Abb. S1. Studiendesign. Abb. S2. Der biologische Prozess (BP), die zelluläre Komponente (CC) und die molekulare Funktion (MF) der Clusterbildung der unterschiedlich exprimierten Proteine ​​in Galle (A) und Überstand (B) durch GO-Analyse. Abb. S3. Die immunhistochemischen Bilder des Gewebe-Microarrays (TMA). Abb. S4. (A) Das Expressionsniveau von Galle CLU bei CCA, Nicht-CCA-Krebsarten und gutartigen Gallenerkrankungen. (B) Das Expressionsniveau von Galle CLU in verschiedenen TNM-Stadien bei CCA-Patienten. (C) Das Expressionsniveau der Gallen-CLU bei jeder gutartigen Gallenerkrankung. (D) Das Expressionsniveau der Gallen-CLU in der Lithiasis-assoziierten CCA-Gruppe, der einzelnen CCA-Gruppe und der Lithiasis-Gruppe. Abb. S5. (A) Lasso-Cox-Regressionsanalyse von 10 Kandidatenmarkern. (B) und (C). tSNE- und DCA-Analyse im externen Validierungssatz.

Die detaillierten Informationen der 635 Patienten im Kreuzvalidierungssatz und im externen Validierungssatz. Tabelle S2. In der Gallenproteomik wurden 1585 Proteine ​​identifiziert. Tabelle S3. In der Zellüberstandsproteomik wurden 932 unterschiedlich exprimierte Proteine ​​gefunden. Tabelle S4. Die Häufigkeit von CLU und CA19-9 in Serum oder Galle in Pilotstudien.

Tabelle S5. Die diagnostischen Werte von Biomarkern und Panels. Tabelle S6. Die AUC-Werte der Top-30-Funktionen. Tabelle S7. Andere Methoden zur CCA-Diagnose.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Gao, L., Lin, Y., Yue, P. et al. Identifizierung eines neuartigen Gallenmarker-Clusters und einer öffentlichen Online-Vorhersageplattform basierend auf Deep Learning für Cholangiokarzinom. BMC Med 21, 294 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02990-9

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Eingegangen: 01. März 2023

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 08. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02990-9

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